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                              反向遗传疫苗技术及其在动物高安全、高效价疫苗研究中的初步应用
                              2014-1-23
                              来源:未知
                              点击数: 3353          作者:未知
                              • 反向遗传疫苗技术及其在动物高安全、高效价疫苗研究中的初步应用 

                                张澍陈稚峰徐明伟王钦富武爱迪 

                                美国威斯康星大学和日本东京大学助理教授 

                                1. 反向遗传学的发展历程: 

                                在病毒学研究中,我们要研究病毒的复制与调控机理,就必须能够对病毒的基因组进行操作,通过对病毒基因组进行核酸序列的插入、缺失、点突变等各项操作对病毒进行分子生物学研究。 

                                DNA病毒、正链RNA病毒和负链RNA病毒等几大类病毒中,对于DNA病毒进行的基因组操作,可以使用编码病毒基因组的质粒转染细胞[1],或者通过对携带病毒基因组中病毒序列的质粒之间进行异源重组来得到实现[234],这在操作上困难最小,所以对DNA病毒进行的基因操作在几类病毒中是最先开始进行的。 

                                对正链RNA病毒基因组进行的操作紧随在DNA病毒后,这在很大程度上是因为,其病毒基因组是mRNA的有义链,简单地对含有特定病毒基因组的质粒,或者将从质粒转录来的RNA转染进入敏感细胞中,就可得到具有感染性的病毒颗粒[ 

                                最难对其基因组进行操作的是负链RNA病毒。这类病毒包括副粘病毒科(Parmyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orhomyxoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)等几大类。很多种类的负链RNA病毒都能给人类带来疾病,诸如流感病毒ABC型,汉坦病毒、拉萨病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、犬瘟热病毒、人类副流感病毒1-3型等等,对人类健康造成了很大的威胁,在医学和社会经济学上具有重大的意义。 

                                负链RNA病毒的基因组是由负链RNA构成的,裸露的负链RNA病毒基因组是不具感染性的。负链RNA病毒与核蛋白、聚合酶蛋白结合在一起,形成病毒核蛋白(vRNP)复合物,用于病毒基因组的复制和翻译[6789] 

                                由克隆出的病毒cDNA产生负链RNA病毒的过程就叫做反向遗传学reverse genetics)。反向遗传学操作首先是在基因组不分节段的负链RNA病毒(副粘病毒、弹状病毒、丝状病毒)中得以实现的。Schnell等人1994年报道,由病毒cDNA克隆成功地产生出具有感染性的狂犬病病毒(一种棒状病毒)[10]。他们把病毒基因组的全长cDNA插入到一个具有T7 RNA聚合酶启动子的质粒中,将此质粒与核蛋白及聚合酶蛋白共同转染进入已感染可表达T7 RNA聚合酶病毒的细胞中,T7 RNA聚合酶翻译出全长的狂犬病毒RNA,然后核蛋白及聚合酶以此为模板,进行复制和翻译,并包装产生具感染性的活病毒。从那之后,应用上述系统,Collins等人1995年报道产生具感染性的人类呼吸道合胞病毒(RSV[11]Garcin 等人1995年得到仙台病毒[12]Radecke等人于1995年得到麻疹病毒[13]Baron等人于1997年获得牛瘟病毒[14]Durbin等人于1997得到人类副流感病毒[15]Buchholz等人于1999年获得牛呼吸道合胞病毒(BRSV[16]Peeters等人于1999年获得新城疫病毒[17]Clarke等人于2000年获得腮腺炎病毒[18]Gassen等人于2000年获得犬瘟病病毒[19]Volchkov等人于2001年得到埃博拉病毒[20]。所有上述的这些病毒都属于不分节段的负链RNA病毒。 

                                在基因组分节段的负链RNA病毒中实现反向遗传学操作、由病毒cDNA产生出活病毒是非常困难的。这可能是因为在此过程中,所有节段的vRNA都需要与核蛋白及聚合酶结合,形成正确的vRNP,以进行下一步的复制和翻译,而这在实际操作中是很难做到的。1996年,Bridgen等人报道从质粒中产生出了Bunyamera病毒(属布尼亚病毒科,基因组分为三段),这是首次由病毒cDNA产生出分节段的负链RNA病毒[21] 

                                应用反向遗传学技术产生出流感病毒,这是一项比上述所有工作都更为艰巨的任务。道理很简单,流感病毒的基因组不仅分节段,而且其节段数目更是达到了八段之多。下面主要介绍反向遗传学在流感研究领域中的发展过程。 

                                2. 反向遗传学在流感病毒研究领域的发展过程: 

                                2.1  流感病毒的特性: 

                                流感病毒在病毒分类学上属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),是一类带包膜、分节段的单链、负链RNA病毒。根据病毒粒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及基因特性的不同,流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,其中甲型和乙型流感病毒基因组均含有8RNA节段,3分子量个最大的RNA节段分别编码聚合酶蛋白PB2PB1PA[22,23];用于形成RNP的核蛋白(NP蛋白)是由第5节段编码的;决定病毒抗原性的糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)则分别是由第4和第6节段编码的;第7节段编码两种蛋白,分别是病毒基质蛋白M1和离子通道蛋白M2;第8节段也编码两种蛋白,分别是非结构蛋白NS1NS2。同一基因节段编码两种蛋白是通过翻译过程中对前体mRNA的剪切来实现的[23]。而丙型流感病毒基因组只含有7RNA节段,少一个编码NARNA节段。甲、乙、丙三型流感病毒都可以感染人类,甲、乙型引起的病症较严重,其中又尤以甲型为甚。 

                                流感病毒的复制是从病毒表面的血凝素结合到宿主细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体上开始的,随后在受体介导下,细胞进行胞吞作用将病毒颗粒吞入形成饮泡。在饮泡内病毒颗粒表面的HA三维结构随即发生改变,内涵体膜与病毒外膜发生融合,同时M2离子通道中氢离子流动使M1vRNPs解离,将vRNPs释放进入胞浆。vRNPs随后被转运进入细胞核,在此进行病毒的复制和转录。vRNA同时作为mRNA和与病毒RNA链互补的cRNA链的模板,合成出mRNAcRNA,随后以cRNA为模板,合成出负链病毒RNA。在胞浆中合成的NP蛋白和聚合酶蛋白被转运入细胞核中,与病毒vRNA一起结合,形成vRNPs. 在感染的后期,在NS2M1蛋白的调节下,新合成的vRNPs从细胞核中被运送到细胞质中,细胞膜内陷将vRNPs包装成为病毒颗粒,随即将其释放出细胞,形成了新的具感染性的病毒颗粒[23] 

                                  

                                2.2 具有生物学活性vRNP复合体的重建: 

                                基于对流感病毒的以上认识,我们知道RNP的重建在流感病毒反向遗传学技术中处于关键性地位。要想应用反向遗传学技术产生出流感病毒,就需要首先解决重建RNP的技术问题。研究者们采取了多种方法来解决这一难题:Honda等人在1987年用去污剂处理病毒,从裂解颗粒中分离出RNP复合体[24]Szewczyk等人在1988年用经纯化的NP蛋白和聚合酶蛋白结合形成RNP复合体[25]Kobayashi等人在1992年从昆虫细胞表达的蛋白中分离出RNP复合体[26]。在此基础上,Parvin等人于1989年用体外重建的RNP转录人工合成的短RNA链获得成功[27]Honda等人于1990年转录流感病毒的全长vRNA链获得成功[28]。由于病毒蛋白的纯化和vRNPs的体外重建是非常困难的,所以这种技术不可能是反向遗传学技术产生出流感病毒的可行途径。尽管如此,这些早期研究还是证明了:流感的三个聚合酶蛋白和NP蛋白结合在一起,就可以进行病毒RNA的转录和复制。 

                                2.3 在辅助病毒的帮助下产生流感病毒: 

                                在前人工作的基础上,研究者们开始致力于解决下一个难题:将人为产生的vRNPs导入到病毒颗粒中。使含有某一流感病毒cDNA的质粒在细胞中表达产生vRNP,使此vRNP与其他辅助病毒感染细胞产生的vRNPs混合在一起,包装在同一个病毒外膜里,产生出有活性的、具有特定基因节段的流感病毒。下面介绍几种利用辅助病毒产生流感病毒的方法: 

                                RNP转染法:Luytjes等人于1989年在以前有关工作的基础上,将外源RNA分子导入流感病毒颗粒的基因组中,首创了流感病毒反向遗传学技术。他们把编码报告基因CAT的碱基序列与流感病毒A/PR/8/34毒株基因组35端非编码区(NS区)相连。经过纯化的流感病毒NP蛋白和RNA聚合酶蛋白在体外实现了CAT负链RNA的转录。人工合成的CAT RNARNP体外组建成vRNP复合体转染已被辅助性流感病毒感染的宿主细胞MDCK,在辅助病毒提供的反式作用因子作用下,CAT基因在细胞中复制、转录和表达,并且形成含有CAT负链RNA的嵌合子代病毒,此病毒在辅助病毒原有的8个这种嵌合病毒经过连续传代仍然可以检测到CAT活性[29]Enami等人应用此种方法,于1990年首次将流感基因组中的一个基因节段用经过突变的相应节段代替,将辅助病毒的NP节段用突变NP节段代替,产生了重组的病毒,这大大有利于通过对病毒基因组进行核酸序列的插入、缺失、点突变等各项操作对病毒进行分子生物学研究,具体的操作步骤请见图6-1[30]。随后, Enami等人于1991[31]Yamanaka等人于1991 

                                  

                                 

                                6-1. RNP转染方法应用于经修饰的流感病毒基因 

                                 

                                 

                                1992[33]Seong等人于1992[34]Li等人于1995[35],分别发表文章,对原有的RNP转染法进行了修饰和改进。RNA聚合酶法:Neumann等人1994年建立了流感反向遗传学的RNA聚合酶系统,用此系统对流感病毒的基因组进行改造。与RNP转染法相比,RNA聚合酶系统不需要体外RNA转录、蛋白质纯化、体外RNP重建及RNP复合体的转染等复杂步骤。他们把一端编码CAT基因的cDNA插入到流感病毒cDNA53非编码区内,整段cDNA的两侧分别是RNA聚合酶的启动子和终止子序列。RNA聚合酶转录产生核糖体RNArRNA,rRNA在结构上与病毒RNAvRNA)一样,都没有5的帽子结构和3polyA尾结构。病毒复制是在细胞核内,而RNA聚合酶也定位于细胞核内。这样,编码流感病毒样CAT RNA(两侧分别是RNA聚合酶的启动子和终止子序列)的质粒就在细胞RNA聚合酶的作用下合成出CAT vRNA。细胞经辅助病毒感染,提供其余必需的vRNPs[36] 

                                2.4 不需辅助病毒帮助的反向遗传学方法: 

                                可以用其他方法取代辅助病毒,从而使流感病毒的反向遗传学技术更加简化。利用表达聚合酶蛋白、NP蛋白的痘苗病毒载体或SV40病毒载体感染宿主细胞,接着用重建的RNP转染。使用病毒载体来驱动外源负链RNA的复制说明,负链RNA的复制与转录需要PB1PB2PANP等因子的参加[37][38]1996Pleschka 等人报道了一种不依赖于辅助病毒的反向遗传学操作方法,即构建HMG启动子控制的PB1PB2PANP基因的重组质粒和真核pol启动子控制的反义表达CAT基因重组质粒,以上5个重组质粒共转染宿主细胞,可以检测到CAT负链RNA、正链RNA生成和CAT活性。这种不依赖于辅助病毒的反向遗传学技术可以避免辅助病毒的干扰作用[39] 

                                2.5 应用辅助病毒反向遗传学技术取得的研究成果: 

                                应用上述系统可以产生在某一个病毒基因节段发生突变的流感病毒。因此我们就可以在流感基因组里大量地引入定点突变,来阐明流感病毒复制的调控机理、各种病毒蛋白的功能及其在病毒生活史中所起的作用。研究者们在这些方面取得了很多成果,现分述如下: 

                                流感病毒启动子的结构与功能:甲型流感病毒基因组的8个病毒RNA节段具有共同的特征,在3端非编码区有12个保守性碱基,在5 端非编码区有13个保守性碱基。因为此现象在所有流感病毒毒株中普遍存在,所以研究者们猜想这些保守性碱基就构成了病毒的启动子。他们采用辅助病毒技术对末端保守区域的每一个碱基都加以突变,并进行研究。研究揭示出,vRNA 3端的12-14位碱基和cRNA 3端的11-13位碱基在病毒的复制和转录过程中起到重要作用,构成了启动子的核心部分[32,40]。进一步的突变试验证明vRNAcRNA35末端都参与构成病毒启动子[41,42,43]。在启动子核心区域存在着两类突变,一类能够破坏启动子的活性,另一类能增强启动子活性。从突变实验中得来的数据表明,在启动子中包含两个区域:区域vRNA 3末端的1-9位碱基和5末端的1-9位碱基,它们对启动子的活性起着关键性的作用;区域vRNA       3末端的10-15位碱基和5末端的11-16位碱基,在此碱基的配对是很重要的[41,44]。这两个区域可能是通过一个柔性连接结合在一起的,而此柔性连接则是由vRNA 5末端第10位的一个未配对碱基形成的[41,44,45]。 基于以上发现,研究者们提出了几种流感病毒启动子结构模型:锅柄” 模型(图6-2A),认为vRNA(cRNA)3端和5端的1-16位碱基形成一个部分互补的双链结构,这种模型缺乏直接的实验证据支持[46]; 餐叉模型(图6-2B),认为区域呈单链构象,区域呈双链构象 [414547]; 螺丝钻模型(图6-2C),认为在区域53末端有很短的自身碱基配对区域,而不是在两个末端之间配对,配对位点是在vRNA两个末端的2位和9位,3位和8位之间,4-7位之间为单链RNA[4448]; 茎环结构(图6-2D),Pritlove等人认为在vRNA5端,而不是在3端存在着茎环结构[49]。 对于启动子的研究主要集中在甲型流感病毒中,Lee等人1996年研究了乙型流感病毒的转录机理,甲、乙型病毒在启动子结构上具有相似的特征。乙型流感病毒的启动子和甲型流感病毒的一样,也是由两个区域构成的:区域中碱基的构成是关键性的,区域中碱基配对是最重要的[50] 

                                 

                                  

                                  

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